Determinación de aglutinogenos

GRUPO SANGUINEO

Objetivo:

El alumno determinara el grupo sanguíneo y el factor Rh de una muestra sanguínea utilizando los antisueros correspondientes y previa demostración correctamente.

Introducción:

Los grupos sanguíneos se han clasificado así por poseer características diferentes, estas características son los antígenos (aglutinogenos) y los anticuerpos (aglutininas) que son los responsables de las reacciones adversas inmunológicas en las transfusiones.

Material: 

• Equipo de venopunción.
• Placa de vidrio excavada. 
• Aplicadores de madera.
• Lanceta estéril.
• 4 Tubos de ensaye (por muestra de sangre).
• Gradilla.
• Centrifuga.

Reactivos:

• Anti-suero A
• Anti-suero B
• Anti-suero D
• Solución isotónica de NaCl al 0.9%

Método en placa excavada:

1. Se utiliza punción cutánea con la lanceta, se deshecha la primera gota y se deposita una gota en cada una de las excavaciones en forma horizontal o se marcan las letras A, B y Rh, y posteriormente se añade una gota de suero en donde le corresponda.
2. Mezclar perfectamente con un aplicador diferente cada una de las preparaciones.
3. Leer el resultado.

Método en tubo de ensaye:

1. Se utiliza la punción venosa, se deposita 2 ml de sangre en un tubo de ensaye con 9.8 ml de solución isotónica de NaCl al 0.9%, para formar una suspensión de eritrocitos al 2%.
2.  Marcar 3 tubos de ensaye con las letras A,B y Rh y depositar el suero que le corresponde.
3. Añadir a los tubos una suspensión de eritrocitos al 2%.
4. Centrifugar a 1000 r.p.m. durante 1 minuto.
5. Sacar los tubos e inmediatamente ver si existe aglutinación.

Interpretación de los resultados:

Resultados:

Método en Placa excavada. "A" Rh Positivo.

Método en Tubo. "A" Rh Positivo.

Conclusión:

Esta practica debe llevarse a cabo con responsabilidad ya que si al dar los resultados del grupo sanguíneo de una persona, no son los correctos y se realizara una transfusión de sangre podría morir por no insertarle la sangre que le corresponde, de ahi en fuera es una practica muy sencilla.

Recuento

DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS

Introducción: 

Consiste en reconocer y valorar las proporciones relativas de las distintas variedades de glóbulos blancos que se observan en un frotis teñido en sangre.

Al conocer la proporción de las células sanguíneas que están presentes en el torrente sanguíneo cualquier trastorno patológico que altere el sistema hematopoyetico podría verse reflejado en un cambio de la proporción de una especie celular. Para el recuento celular diferencial se tiene que observar un mínimo de 100 leucocitos.

Material y reactivos:   

• Frotis sanguíneo teñido
• Microscopio
• Aceite de inmersión
• Liquido de wright
• Buffer
• Cuba
• Agua corriente

Tinción de wright.

1. Colocar el frotis secado al aire sobre una cuba de tinción con la sangre hacia arriba. 
2. Cubrir completamente el portaobjetos de Wright. 
3. Dejarlo que permanezca en el frotis aproximadamente de 5-8 minutos, para fijar los glóbulos sanguíneos. El colorante deberá cubrir completamente el portaobjetos, pero no debe derramarse por los bordes. Deberá agregarse una cantidad adicional si éste se comienza a evaporar. 
4.  Agregar directamente al colorante un volumen igual de buffer, para evitar la coloración débil. Esperar la formación de brillo metálico. Dejar actuar de 10-15 minutos. 
5.  Lavar con agua en el chorro cuidadosamente hasta que la extensión presente un aspecto rosado al examinarlo a simple vista. 
6.  Limpiar el dorso del portaobjetos con una gasa para eliminar cualquier resto de colorante. 
7. Secar al aire y observar con el microscopio con el objetivo de inmersión.

Procedimiento.

1. Se coloca el frotis en el microscopio y se enfoca.
2. Se le agrega una gota de aceite de inmersión y se observa con el objetivo de 100x.
3. Si el recuento se hace linea se empieza en un borde del frotis hasta el otro borde en linea paralela hasta contar 100 leucocitos.
4. Se van contando los mononucleares (monocitos y eosinofilos) y los polimorfo nucleares (neutrofilos, eosinofilos y basofilos) según su morfología.
5. Se reportan en % (valor) o en valor absoluto (mm³).

Valores de referencia:

                                     Adultos                                         Niños

Linfocitos                     20-55%                                        20-50%

Monocitos                       2-6%                                            0-9%

Eosinofilos                       1-5%                                            0-8%

Basofilos                          0-1%                                            0-1%

Neutrofilos                   45-70%                                        20-60%

Bandas                            0-5%                                             1-6%

Resultados:

Manuel.

Linfocitos                     35%                                       

Monocitos                      3%                                            

Eosinofilos                      7%                                            

Basofilos                         0%                                            

Neutrofilos                    56%                                        

Bandas                            0%

Omar.

Linfocitos                     39%                                       

Monocitos                      3%                                            

Eosinofilos                      1%                                            

Basofilos                         0%                                            

Neutrofilos                    57%                                        

Bandas                            0%

Conclusión:

Es una practica muy sencilla, fácil de realizar, quizá cueste trabajo aprender a localizar  a cada leucocito pero debido a sus características únicas es mas fácil identificarlos y si se tiene un buen frotis se verán mejor.

CONTEO

LEUCOCITOS

OBJETIVO

Aprender a realizar y aplicar la metodología para un recuento de Leucocitos por milímetro cúbico de sangre e interpretar el resultado.

FUNDAMENTO

Para el conteo de leucocitos, se usan métodos sistemáticos que son más rápidos y precisos, y los métodos manuales.

Todo método manual de recuento celular incluye 3 fases:

ü  Dilución de la sangre

ü  Muestreo de la sangre diluida en un volumen

ü  Recuento de células en ese volumen

Para el recuento de leucos se cuentan los 4 cuadrados de las esquinas, que corresponden a los  campos 1, 3,7 y 9.

MATERIAL

v  Pipeta de Thoma para glóbulos blancos.

v  Boquilla blanca.

v  Papel parafilm.

v  Cámara de Neubauer.

v  Cubrehematimetro.

v  Microscopio.

v  Gasas.

v  Liquido de Turk 

PROCEDIMIENTO

1.    Colocar el tubo de plástico y la boquilla para aspirar en la pipeta.

2.    Llenar la pipeta de glóbulos blancos con sangre hasta la marca 0.5. Limpiar la punta con gasa o papel absorbente. Si la sangre se pasa de la marca, se puede absorber con gasa el excedente.

3.    Introducir la pipeta en el tubo  que contiene el diluyente (liquido de Turk) y absorber hasta la marca 11, no deben quedar burbujas.

4.    Se tapan ambos extremos de la pipeta con papel parafilm y se coloca en un rotador automático o se hace rotar manualmente de 2-3 minutos

5.    Montar el cubrehematimetro de vidrio en la cámara para recuento.

6.    Destapar la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo, luego colocar una gota pequeña cerca de un extremo de la cámara para que por capilaridad se llene exactamente.

7.    Dejar 3 minutos  que los leucocitos se sedimenten

8.    Colocar en la platina del microscopio y enfocar la cuadricula a 10x. y contar  en los 4 cuadrados angulares.

RESULTADOS

N° de leucocitos x mm³ = N° de leucocitos contados por 50

En el análisis hecho,  los resultados de la cuenta de células quedaron así por casilla:

Muestra 1 (Manuel): 5,900 mm³

Muestra 2 (Omar): 8,400 mm³

VALORES DE REFERENCIA

Hombres y Mujeres:………………………………..5 000-10 000

CONCLUSIÓN

El conteo de leucocitos manual es una practica sencilla de llevar acabo y es muy útil para el diagnostico de enfermedades.

Recuento

RETICULOCITOS

Introducción:

Los reticulocitos son eritrocitos jóvenes y contienen en su interior RNA-ribosomal el cual puede observarse en forma de red mediante su colorante supravital.

Cuando en la medula osea aumenta la eritropoyesis, aumenta también el número de reticulocitos que salen hacia la circulación.

Material:

• Sangre venosa con EDTA.
• Colorante azul de cresil brillante.
• Tubos de ensaye.
• Portaobjetos.
• Pipetas Pasteur tallo corto con bulbo.
• Baño maria.
• Microscopio.
• Aceite de inmersión.

Procedimiento:

1. Mezclar la muestra de sangre y en un tubo de ensaye colocar 5 gotas con la pipeta Pasteur. 

2. Agregarle 5 gotas del colorante con otra pipeta Pasteur y mezclar.

3. Incubar el tubo de ensaye a 37°c durante 15 min. en el baño maria.

4. Mezclar la suspensión y realizar en frotis en un portaobjetos.

5. Dejar secar a temperatura ambiente, agregar una gota de aceite de inmersión y observar con el objetivo de 100x .
6. Buscar células que presenten una red con coloración azul (reticulocitos)
Contar 1000 eritrocitos en diferentes partes del frotis e ir observando el número de reticulocitos observados. 

Resultado:

Numero de reticulocitos observados x 100                   20 x 100       

______________________________             __________ =2 %  

           Número total de eritrocitos                                      1000

                                                                                                 7 x 100

                                                                                          __________ =0.7 %

                                                                                                   1000

Valores de referencia:

Adultos 0.5-2.0 %

Recién nacidos 2.5-6.5 %

Comentario:

Una práctica fácil y sencilla que te da un buen resultado para localizar los reticulocitos.

INDICES ERITROCITARIOS

VALORES ABSOLUTOS

N° de eritrocitos contados: 3 950 000

Hematocrito: 43 %

Hemoglobina: 15.4 g/dl

Valor hto % x 10            430               

_____________  =   _______   =  110.25 M³  V.C.M            VALORES NORMALES

N° eritrocitos/litros         3.9                                                                      82-92 M³

    Hb en g/dl x 10             154          

_______________  =  _______  = 39.48 pg. H.C.M                 VALORES NORMALES

 N° eritrocitos/litros          3.9                                                                      28-32 pg


  Hb en g/dl x 100      1540
_____________  =  ______  =  35.81 %  C.H.C.M                    VALORES NORMALES

     Valor hto %            43                                                                           35-36 %   

OBSERVACIONES:

El unico valor que esta dentro de lo normal es la C.H.C.M, lo mas probable es que nos hayamos equivocado al contar los eritrocitos. 

CONCLUSION:

Sacar los valores absolutos es fácil y rápido, sirven para clasificar a las anemias aunque los valores que proporciona son aproximados.

HEMATOCRITO

DETERMINACION DE HEMATOCRITO

Material:

• ü  Tubo de wintrobe
• ü  Tubo capilar
• ü  Un pedazo de plastilina
• ü  Centrifuga
• ü  Microcentrifuga
• ü  Pipeta Pasteur (tallo largo)
• ü  Equipo para venopunción
• ü  Lector para hematocrito o regla

Técnica macrometodo

1.        Mezcla la muestra sanguínea suavemente y con una pipeta Pasteur llena el tubo wintrobe, colocando la punta de la pipeta hasta el fondo del tubo, la punta de la pipeta se va elevando pero permaneciendo por debajo del menisco de sangre para evitar la formación de burbujas o espuma.
2.          El tubo se llena hasta la marca 100 con la muestra sanguínea y se pone a centrifugar durante 30 minutos a 3000 r.p.m.
3.             Se efectúa la lectura.

       

Técnica micrométodo

1.        Mezclar la muestra sanguínea adecuadamente y llenar un tubo capilar hasta ¾ partes.
2.        El extremo vacio que no estuvo en contacto con la sangre se llena con plastilina o calor.
3.        El tubo con la muestra sanguínea se coloca en la microcentrifuga a 10000 r.p.m durante 10 minutos.
4.        Leer el porcentaje de hematocrito en el lector o medirlo con una regla.

Resultado:

Al medir con la regla dio un porcentaje de 45% de glóbulos rojos, lo que indica que esta normal de acuerdo a los rangos 42.0 ± 5.0 en una mujer.

Nota: La muestra era de una mujer.

Conclusión:

La finalidad de esta práctica es saber el recuento adecuado de eritrocitos y da una medición exacta de hemoglobina. Es muy exacto y sencillo.

HEMOGLOBINA

DETERMINACIÓN DE HEMOGLOBINA

Objetivo: Determinar cuántos gr. de hemoglobina (Hb) hay en toda la sangre circulante, para tener un diagnostico clínico ya que pueden variar diversas enfermedades debido a un valor anormal de hemoglobina.

Fundamento: Los principales componentes de la Hemoglobina son: El grupo Hem y la Globina. La médula ósea roja y el Hígado son los principales productores del Hem.

La Hemoglobina se puede cuantificar en el laboratorio por métodos colorimétricos, como el de la “Cianometahemoglobina” utilizando el reactivo de Drabkin, el cual contiene bicarbonato de potasio a una concentración tal que los eritrocitos al contacto con esta solución explotan, dejando libre la Hemoglobina.

La sangre se diluye en líquido de Drabkin, el cual hemoliza los hematíes y convierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemoglobina). La solución que se produce se lee por medio de un espectrofotómetro o fotocolorímetro. Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad de hemoglobina que contenga la sangre.

Materiales y reactivos:  

·         Un colorímetro fotoeléctrico o un espectrofotómetro.

·         Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 0,02 mL, con tubo de goma y boquilla.

·         Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL

·         Tubos de ensayo.

·         Reactivo de Drabkin para dilución.

Técnica:

1.- En un tubo de 13 x 100 colocar exactamente 5 mL de reactivo de Drabkin, marcarlo como problema (P). Obtener 5 ml de sangre venosa con anticoagulante (EDTA). 

2.- Mezclar perfectamente la sangre problema, por inversión por lo menos 20 veces antes de tomar la muestra. Con una pipeta automática o pipeta de Shali se toma exactamente 0,02 mL (20 µL) de sangre total, limpiar luego la punta de la pipeta y se vierte en el tubo que contenga reactivo de Drabkin. Se enjuaga 3 veces y se mezcla.

3.- Mezcle la solución de Drabkin con la sangre por inversión y con mucha precaución (utiliza parafilm para tapar los tubos, recuerda que el reactivo tiene cianuro, el cual es un VENENO)

4.-Dejar en reposo por espacio de 3 a 5 minutos. Para que se  efectúe la reacción. Después de ese tiempo se observara una coloración roja transparente, se procede a realizar la lectura.

5.-Leer en absorbancia con filtro verde a 540 nm llevando a cero el fotómetro con agua destilada / Drabkin.

MEDICIÓN EN EL ESPECTROFOTÓMETRO.

Medición de Transmitancia: 

1.- Encender el Espectrofotómetro 30 minutos antes, después  seleccione la longitud de onda deseada (540 nm para Hb) con las teclas numéricas y oprima <GO TO>.  Aparecerá en la pantalla el valor numérico.

2.-Presine < %T> para Transmitancia.

     Aparecerá en la pantalla “T”.

3.-Insertemla cubeta con el blanco en el portacubeta, cierre la puerta y oprima <SECOND FUNCTION> Y <100 %>. Aparecerá En la pantalla 100.0 T.

4.-Remueva el blanco e inserte la muestra problema contenida en la celda y cierre la puerta.

 Aparecerá en la pantalla el valor en Transmitancia.

5.-Retire la cubeta del compartimiento y cierre la puerta (lave la cubeta y  guárdela)

6.-Si no va usar más el aparato, apáguelo y cúbralo, si desea continuar trabajando, elija el modo de trabajo siguiente y continúe.

Resultado:

Para sacar el total de Hb se hace lo siguiente Hb total = concentración de Hb (gr/ml) x volumen sanguíneo (ml).
en espectrofotómetro se aplica la siguiente fórmula:
muestra/ estandar x 15 = Hb.

Cálculos: .353/.340x15 = 15.574 gr/dl.

Observación:

Al saber el total de Hg era 15.574   identificamos que la sangre era de una mujer y que está dentro del rango normal de Hb.

Valores de referencia:

Mujeres……………………………………... 12 - 16 g/dl

Hombres……………………………………. 14 - 17 g/dl

Conclusión:

Esta práctica es rápida y fácil para llevar a cabo la determinación de hemoglobina, aunque es un poco cara por el reactivo que lleva, pero es certero el resultado si lo haces bien.

.